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Agilent 1260 Infinity II的自動(dòng)化柱前衍生功能**實(shí)現(xiàn)伏馬毒素FB1和FB2的高通量檢測(cè)
來源:安捷倫科技有限公司 | 作者:安捷倫科技有限公司 | 發(fā)布時(shí)間: 2019-03-29 | 2675 次瀏覽 | 分享到:
本方法是基于Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)開發(fā)出的一種用于測(cè)定伏馬毒素的自動(dòng)化柱前衍生高通量液相色譜檢測(cè)方法，我們從靈敏度、重現(xiàn)性和線性范圍三個(gè)方面對(duì)該方法的性能進(jìn)行了考察。該方法利用自動(dòng)進(jìn)樣器程序進(jìn)樣功能、自動(dòng)吸取 OPA 衍生試劑和樣品，避免了傳統(tǒng)柱前衍生過程中人為量取、混合和等待等繁瑣操作以及隨之引入的誤差，確保了批次間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，有助于實(shí)現(xiàn)伏馬毒素的高通量檢測(cè)。通過該方法，F(xiàn)B1 和FB2 的檢測(cè)限可達(dá) 300 pg/mL 左右，定量限可達(dá) 1 ng/mL 左右，保留時(shí)間 RSD% 均小于0.2%， 10–2500 ng/mL 范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于 0.9999。
簡(jiǎn)介
        伏馬毒素 (FUM) 是一種強(qiáng)毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小 麥、大米等糧食作物中，對(duì)動(dòng)物和人的健康有很大的潛在危害[1]。 1993 年，伏馬毒素被**衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為 2B 類 致癌物（即人類可能致癌物）[2]。 目前發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、 FC2、FC3、FC4 和 FP1 等 11 種，其中主要組分為 FB1，已成 為繼黃曲霉毒素之后的又一研究熱點(diǎn)。目前，我國對(duì)伏馬毒素尚 無明確的限量規(guī)定，但許多組織、**已對(duì)伏馬毒素制訂了限 量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟對(duì)伏馬毒素（FB1 和 FB2）的總量規(guī)定玉米中限量 為 4 mg/kg[3]；瑞士規(guī)定人類食物中伏馬毒素限量為 1 mg/kg[4]； 美國 FDA 規(guī)定以玉米為原料的食品中 FB 的*大限量為 2–4 mg/kg， 動(dòng)物食品為 5–100 mg/kg[5]。 我國頒布的食品安全**標(biāo)準(zhǔn)中，伏馬毒素的液相色譜檢測(cè)方法 包括柱后衍生和柱前衍生兩種[3]。柱后衍生方法分析時(shí)間較長(zhǎng)， 且儀器配置除了一臺(tái)液相色譜外，還需要一套柱后衍生系統(tǒng)。而 柱前衍生方法步驟又非常繁瑣，需要先用移液器分別移取 100 μL 樣品和衍生試劑，再加入樣品瓶渦旋約 30 秒，并在 2 分鐘內(nèi)進(jìn) 樣分析，整個(gè)衍生時(shí)間需要人為控制。而且，為了保證衍生反應(yīng) 時(shí)間一致，必須完成一針進(jìn)樣后才能做下一個(gè)樣品前處理，整個(gè) 過程需要操作人員全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016 食品安全**標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒 素的測(cè)定》[6] 中規(guī)定的柱前衍生方案的基礎(chǔ)上，運(yùn)用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)的程序進(jìn)樣功能，開發(fā)出一種自動(dòng)化柱前 衍生的高通量快速分析方法。該方法無需額外配置設(shè)備，無需人 員值守，具有良好的重現(xiàn)性，而且定量限和檢測(cè)限指標(biāo)**滿足 各項(xiàng)主要法規(guī)的要求。

實(shí)驗(yàn)部分
儀器和設(shè)備
Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)，配備如下安捷倫組件：
– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件號(hào) G7111B）
– Agilent 1260 Infinity 標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7129B）
– Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部件號(hào) G7116A）
– Agilent 1260 Infinity 熒光檢測(cè)器（部件號(hào) G7121B），配備標(biāo)準(zhǔn)檢 測(cè)池 (8 μL)

標(biāo)樣配制
        將伏馬毒素 FB1 和 FB2 標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液用乙腈/水 (50%/50%) 逐級(jí) 稀釋為 2500、500、250、125、75、25 和 10 ng/mL，分別對(duì)應(yīng) 于濃度級(jí)別 7、6、5、4、3、2、1。

表 1. 標(biāo)樣配制 

自動(dòng)衍生步驟
        硼砂溶液和衍生試劑參照《食品安全**標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的 測(cè)定》中第三法的規(guī)定進(jìn)行配制。 硼砂溶液 (0.1 mol/L)：稱取硼砂 3.8 g，用水溶解并稀釋至 100 mL，混合均勻。取該溶液 1 mL 置于 2 mL 樣品瓶中，放在 自動(dòng)進(jìn)樣器的 P1-A1 位置。
        衍生試劑：準(zhǔn)確稱取 40 mg 鄰苯二甲醛，溶于 1 mL 甲醇中，用 5 mL 硼砂溶液進(jìn)行稀釋，并加入 50 μL 2-巰基乙醇，混合均勻。 取該溶液 100 μL 置于 250 μL 內(nèi)插管中，然后將內(nèi)插管放入 2 mL 棕色樣品瓶中，放在自動(dòng)進(jìn)樣器的 P1-A2 位置。剩余衍生試劑放 入 –20 °C 冰箱中冷藏，1 周內(nèi)使用未發(fā)現(xiàn)異常。

表 2. 自動(dòng)衍生方法設(shè)置


色譜條件
色譜柱    Zorbax RRHD Plus C18, 3.0 × 50 mm, 1.8 μm
柱溫 40 oC 
進(jìn)樣量 4 μL（自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)衍生） 
流動(dòng)相 A 相：10 mmol/L KH2PO4，pH 2.3（H3PO4 調(diào)節(jié)）
B 相：MeOH/ACN (50%/50%) 
流速 0.8 mL/min 
熒光檢測(cè)器 激發(fā)波長(zhǎng)：335；發(fā)射波長(zhǎng)：440；PMT 增益：12；采樣頻率：9.26 Hz
剃度時(shí)間表 時(shí)間（min）                    B%
        0                            50
        3                            70
        6                            70
        6.1                         50       
        9                            50                         

結(jié)果與討論
        使用上述方法對(duì)伏馬毒素 FB1 和 FB2 標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析，第 5 級(jí) 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品分析結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果表明，采用 Plus C18 超**短色譜柱對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行分離，能夠在 9 min 內(nèi)獲得良好 的分離效果，分離時(shí)間較**標(biāo)準(zhǔn)方法所需的 16 min 縮短了近 一半。

圖 1. 250 ng/mL 伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品中 FB1 和 FB2 的分離結(jié)果



峰面積和保留時(shí)間重現(xiàn)性考察
        對(duì)第 3 級(jí)濃度 (75 ng/mL) 的伏馬毒素標(biāo)樣進(jìn)行 5 次重復(fù)分析，以 考察峰面積和保留時(shí)間的重現(xiàn)性。結(jié)果顯示 FB1 和 FB2 的保留時(shí) 間 RSD% 均小于 0.2%，且峰面積 RSD% 均小于 1.1%，滿足** 標(biāo)準(zhǔn)中兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值不超過算數(shù)平均值 20% 的要求， 具體結(jié)果見表 3。之所以能夠獲得良好的峰面積重現(xiàn)性，主要是 由于自動(dòng)化柱前衍生過程中涉及的樣品和溶劑的量取均采用高精 度計(jì)量泵來實(shí)施。而且，整個(gè)衍生反應(yīng)流程一致，時(shí)間恒定，從 而使得衍生效果穩(wěn)定，定量結(jié)果可靠。
表 3. FB1 和 FB2 的保留時(shí)間和峰面積重現(xiàn)性 (n = 5)

線性范圍考察
        依次將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品按濃度從低到高進(jìn)樣，每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn) 樣三次，以濃度為橫坐標(biāo)、每個(gè)濃度下 FB1 和 FB2 峰面積的平均 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖 2 所示。無論是在低濃度范 圍 (10–500 ng/mL) 還是在高濃度范圍 (10–2500 ng/mL)，F(xiàn)B1 和 FB2 均獲得了良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于 0.9999。

圖 2. FB1 和 FB2 的低濃度范圍（10–500 ng/mL，A 和 C）和高濃度范圍（10–2500 ng/mL，B 和 D）標(biāo)準(zhǔn)曲線


靈敏度考察
        對(duì)第 1 級(jí)濃度 (10 ng/mL) 的標(biāo)樣進(jìn)樣分析以考察方法的靈敏度。結(jié)果如圖 3 所示。在該濃度下，F(xiàn)B1 的信噪比為 94，F(xiàn)B2 的信 噪比為 143。由此推斷，F(xiàn)B1 和 FB2 的檢測(cè)限可達(dá) 300 pg/mL 左右，定量限可達(dá) 1 ng/mL 左右；而**標(biāo)準(zhǔn)中指出，當(dāng)稱樣量為 5 g 時(shí)，F(xiàn)B1、FB2 的檢測(cè)限分別為 17 μg/kg、8 μg/kg，定量限分別為 50 μg/kg、25 μg/kg。因此，本方法**滿足**標(biāo)準(zhǔn)方法 要求。

圖 3. 10 ng/mL 伏馬毒素標(biāo)樣中 FB1 和 FB2 的分離結(jié)果


結(jié)論
        本研究使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)的程序進(jìn)樣功 能，對(duì)伏馬毒素 FB1 和 FB2 進(jìn)行自動(dòng)衍生，可有效防止 FB1 和 FB2 衍生產(chǎn)物的降解。與**標(biāo)準(zhǔn)方法相比，該方法可大幅提高 檢測(cè)效率，降低實(shí)驗(yàn)室人工成本。并且該方法具有非常良好的靈 敏度、線性和重現(xiàn)性，檢測(cè)結(jié)果可靠，是一種非常適合于大批量 樣品高通量分析的方法。


參考文獻(xiàn)
1. W.J. Kong, et al. Analysis of fumonisins B1 and B2 in spices and aromatic and medicinal herbs by HPLC-FLD with on-line post-column derivatization and positive confirmation by LCMS/MS. Analyst, 2012, 137: 3166-3174
2. K. C.Piancentini, et al. Mycotoxin analysis of industrial beers from Brazil: The influence of fumonisin B1 and deoxynivalenol in beer quality. Food Chem. 2017, 218: 64-69
3. SENYUVA Hamide, et al. Determination of Fumonisins B1 and B2 in Corn by LC/MS with Immunoaffinity Column Cleanup: Interlaboratory Study. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 2010, 93, 611-621
4. Ildiko′Barna-Vetro′, et al. Development of a sensitive ELISA for the de termination of fumonisin B1 in cereals. J Agric Food Chem. 2000, 48, 2821- 2825
5. USFDA. Draft guidance for industry: fumonisin levels in human foods and animal feeds. 2006 6. GB5009. 240-2016 食品安全**標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的測(cè)定

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